Cas12a2 provoca infecção abortiva através de RNA

Nov 06, 2023

Nature volume 613, páginas 588–594 (2023) Cite este artigo

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Os sistemas de infecção abortiva bacteriana limitam a disseminação de invasores estranhos desligando ou matando as células infectadas antes que os invasores possam se replicar1,2. Vários sistemas CRISPR-Cas direcionados ao RNA (ou seja, tipos III e VI) causam fenótipos de infecção abortiva ativando nucleases indiscriminadas3,4,5. No entanto, um mecanismo abortivo mediado por CRISPR que alavanca a atividade indiscriminada da DNase de uma nuclease de efetor único guiada por RNA ainda não foi observado. Aqui, relatamos que o direcionamento de RNA pela nuclease de efetor único tipo V Cas12a2 impulsiona a infecção abortiva por meio da clivagem não específica do DNA de fita dupla (dsDNA). Depois de reconhecer um alvo de RNA com uma sequência ativadora de flanqueamento do protoespaçador, Cas12a2 degrada eficientemente o RNA de fita simples (ssRNA), o DNA de fita simples (ssDNA) e o dsDNA. Dentro das células, a ativação de Cas12a2 induz uma resposta SOS de dano ao DNA e prejudica o crescimento, impedindo a disseminação do invasor. Finalmente, aproveitamos a atividade colateral de Cas12a2 para detecção direta de RNA, demonstrando que Cas12a2 pode ser reaproveitado como uma ferramenta de direcionamento de RNA guiada por RNA. Essas descobertas expandem as habilidades defensivas conhecidas dos sistemas CRISPR-Cas e criam oportunidades adicionais para as tecnologias CRISPR.

Todos os domínios da vida usam estratégias de defesa que fazem com que as células entrem em dormência ou morram para limitar a propagação de agentes infecciosos1. Em bactérias e archaea, essa estratégia é chamada de infecção abortiva e é utilizada por uma grande variedade de sistemas de defesa bacteriana1,2. Recentemente, foi demonstrado que os sistemas imunes adaptativos guiados por CRISPR RNA (crRNA) que têm como alvo o RNA causam fenótipos de infecção abortiva3,4,5,6. Os sistemas do tipo VI degradam o RNA de forma não específica, em que a nuclease efetora única Cas13 atua tanto como um efetor guiado por crRNA quanto como RNase indiscriminada3,7,8. Nos sistemas do tipo III, a ligação do RNA alvo desencadeia a produção de mensageiros secundários oligoadenilatos cíclicos que, por sua vez, ativam RNases acessórias indiscriminadas e ssDNases que podem levar à infecção abortiva4,5,9,10,11. Além disso, foi proposto que a infecção abortiva é mediada por dsDNases indiscriminadas (como NucC) ativadas por meio de mensageiros secundários tipo III12,13 ou por atividade indiscriminada de ssDNase de nucleases de efetor único tipo V Cas12a14. No entanto, a atividade dsDNase mediada por CRISPR tipo III ainda não foi examinada in vivo, e a atividade ssDNase de Cas12a demonstrou recentemente não causar infecção abortiva15.

Aqui, relatamos que Cas12a2, uma nuclease associada a CRISPR (Cas) de efetor único tipo V, induz um fenótipo de infecção abortiva quando desafiada com plasmídeos que são complementares aos guias de crRNA. Ensaios bioquímicos usando proteína recombinante revelaram que Cas12a2 reconhece alvos de RNA, desencadeando atividades não específicas de dsDNA, ssDNA e ssRNA-nuclease distintas daquelas de outras subunidades únicas de direcionamento de RNA (como Cas13a) e direcionamento de dsDNA (como Cas12a ) Cas nucleases8,16,17. Além disso, mostramos que as atividades não específicas da nuclease Cas12a2 danificam o DNA bacteriano, desencadeando a resposta SOS e prejudicando o crescimento celular. Coletivamente, esses resultados sugerem que a atividade dsDNase de Cas12a2 é fundamental para desencadear o fenótipo de infecção abortiva. Como demonstração de prova de princípio, mostramos que Cas12a2 pode detectar RNA com uma sensibilidade comparável à da nuclease Cas13a direcionada a RNA em várias temperaturas.

Cas12a2 compreende um grupo de nucleases efetoras do tipo V que estão relacionadas a Cas12a16, com os ortólogos de Cas12a2 sendo anteriormente classificados como variantes de Cas12a18. Nossas análises também os colocam em um clado monofilético que compartilha o último ancestral comum com as nucleases Cas12a (Fig. 1a e Extended Data Fig. 1). Análises adicionais revelaram que os sistemas CRISPR-Cas12a2 e CRISPR-Cas12a apresentam repetições CRISPR com uma extremidade 3' conservada e as nucleases possuem domínios de endonuclease RuvC homólogos e uma estrutura secundária prevista semelhante nos terminais N (Fig. 1b e Fig. Complementar. 2) . Apesar dos domínios conservados do tipo RuvC e N terminais, Cas12a2 se distingue de Cas12a pela presença de um grande domínio de função desconhecida localizado no lugar da hélice da ponte Cas12a, bem como um domínio de dedo de zinco no lugar do domínio Cas12a Nuc ( Fig. 1b e Fig. Complementar 2). Considerando sua classificação original combinada com nossas análises filogenéticas, bem como resultados estruturais recentes19, nomeamos essas nucleases de tipo V distintas como Cas12a2.